荧光定量PCR检测HBV—DNA与ELISA检测乙肝两对半700例样本分析(1)
【摘 要】目的：分析乙肝病毒核酸(HBV-DNA)含量检测的结果及其与乙肝血清标志物检测结果的一致性。方法：用荧光定量PCR和ELISA两种方法检测700 份乙肝患者血清，并对其结果进行分析[1]。结果：700 例HBV-DNA定量检测阳性355例，阴性345例；大三阳检出共254例，阳性检出率98%，平均拷贝数4.38E+06/ml；小三阳检出共333例，阳性检出率19.5%，平均拷贝数3.98E+04/ml；表面抗原(HBs-Ag)和核心抗体(HBc-Ab)阳性检出共100例，阳性检出率33%；平均拷贝数2.71E+04/ml；表面抗原(HBs-Ag)和e抗原(HBe-Ag)检出共13例，阳性检出率61.6%，平均拷贝数6.21E+06/ml。结论：乙肝患者两对半检出的各种类型中均有病毒复制和无复制现象，大三阳中以复制为主，但也有少许无复制患者，小三阳以无复制为主，但也有部分患者出现复制现象，一般处于低复制状态[2]。纵观所有， HBe-Ag在阳性的情况下HBV-DNA检测出的阳性率也高，二者呈正相关[3]，鉴于这些情况运用PCR技术定量检测HBV-DNA能准确反映HBV的真实感染和复制情况[4]。两者联合检测在临床乙型肝炎诊断、治疗、预后方面有重要意义。
【关键词】乙型肝炎病毒；PCR；ELISA
乙肝病毒感染的诊断主要依赖于测定血清中乙肝病毒抗原一抗体标志物和乙肝病毒核酸(HBV-DNA)含量，为了解彼此间的关联性，作者运用两种方法检测乙肝患者血清，并对其结果进行对比分析，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源
所有标本来自2012年6月至2013年12月岷县人民医院住院及门诊病人的血清标本。
1.2 仪器与试剂
血清HBV-DNA检测使用广州中山达安荧光定量PCR检测仪DA-7600，试剂来自广州达安股份有限公司生产试剂盒。血清乙肝抗原一抗体标志物检测采用深圳雷杜酶标仪，上海科华生物工程有限公司乙型肝炎诊断试剂盒。
1.3 方法
1.3.1 HBV-DNA采用核酸扩增(PCR)荧光定量检测法，用已知含量梯度(2.0×10^6，2.0x10^5，2.0×10^4，2.0×10^3)的HBV-DNA标准品为参照物，经荧光定量PCR扩增后所得荧光值经数据转换，制出一条标准曲线，待测样品的荧光值进行对比得出其样本DNA含量。检测中同时设置阴阳性对照。严格按照试剂盒操作要求，在对样本做了预处理之后取2ul上清液加入反应管上机，按下列条件进行扩增：①先93℃2min；②然后按93℃45s～55℃60s10个循环后进入下一环节；③93℃30s～55℃45s 30个循环后，反应结果由仪器自动分析，直接得出血清标本的病毒拷贝数。
1.3.2 乙肝五项采用 ELISA法测定，试剂盒购自上海科华生物工程有限公司乙型肝炎诊断试剂盒，操作严格按照试剂盒说明。
1.4 结果判断
根据试剂盒说明 PCR 荧光定量<1×1O^3拷贝数/ml为无复制，判断为阴性。≥1.1×10^3拷贝数/ml为病毒复制，判断为阳性。
1.5 统计学处理
各种类型人为分组，见下表。 HbsAg-HbeAg-HbcAb(1，3，5) 阳性， HbsAg-HbeAb-HbcAb(1，4，5) 阳性，HbsAg- HbcAb(1，5)阳性，HbsAg-HbeAg(1，3)阳性，HbsAg(1阳)，乙肝病毒标志物与荧光定量PCR 扩增结果相互比较，得出比率。
2 结果
700 例HBV-DNA定量检测结果中，345例HBV-DNA阴性，355 例阳性；>10^5拷贝例数252例。EIISA检测HBV标志物与HBV-DNA含量的结果比较，乙肝HbsAg，HbeAg，HbcAb阳性组(俗称大三阳)254例，其中HBV-DNA阳性检出率为98%，阴性检出率为2%；乙肝HbsAg，HbeAb，HbcAb 阳性组(俗称小三阳)333例，标志物中所占比例最高[5]，HBV-DNA阳性检出率为19.5%，阴性检出率为80.5%；HbsAg-HbcAb阳性100例，阳性检出率为33%，阴性检出率为67%；HbsAg-HbeAg阳性13例，阳性检出率为61.6%，阴性检出率为38.4%。HbsAg阳5例，阳性检出率为0。
3 讨论
荧光定量PCR方法，是使分析扩增产物全过程在一个封闭体系下完成，并且进行实时动态监测，图形直观，自动得出定量结果，且结果具有更高的特异性和敏感性。本组HBV-DNA定量结果显示，700例病人血清PCR阳性检出率达50.7(355/700)， HbsAg，HbeAg，HbcAb 阳性组(俗称大三阳)254例，其中HBV-DNA阳性检出率98%；>10^5以上210例，占83%；阴性检出率2%；乙肝HbsAg，HbeAb，HbcAb阳性组(俗称小三阳)333例，HBV-DNA阳性检出率19.5%，>10^5以上23例，占6.9%，阴性检出率80.5%；HbsAg- HbcAb阳性100例，阳性检出率33%，>10^5以上，11例，占11%，阴性检出率67%；HbsAg-HbeAg阳性13例，阳性检出率61.6%，>10^5以上，8例，占61.6%，阴性检出率38.4%。资料显示，大三阳也有少量病例病毒不复制，即为阴性。而小三阳，主要为阴性，但也有部分病例出现阳性结果。小三阳患者中HbeAb的出现，传统认为乙肝病毒DNA 含量下降，传染性降低.但实际并不表示患者体内已没有病毒复制， (下转至第40页)
(上接至第22页)
由于HbeAg前体的分泌变异可以在血清中不表达出HbeAg，因而HbeAg阴性仍可引起宿主持续免疫应答，表现为HbeAb阳性，故小三阳患者同样有传染性。至于其他类型有阴有阳，分析提示HbeAg的存在与HBV-DNA浓度有高度的相关性，此时肝炎病毒可能处于复制期，传染性较强。, http://www.100md.com(王莉萍 屈雪琴 郎玉霞)
【关键词】乙型肝炎病毒；PCR；ELISA
乙肝病毒感染的诊断主要依赖于测定血清中乙肝病毒抗原一抗体标志物和乙肝病毒核酸(HBV-DNA)含量，为了解彼此间的关联性，作者运用两种方法检测乙肝患者血清，并对其结果进行对比分析，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源
所有标本来自2012年6月至2013年12月岷县人民医院住院及门诊病人的血清标本。
1.2 仪器与试剂
血清HBV-DNA检测使用广州中山达安荧光定量PCR检测仪DA-7600，试剂来自广州达安股份有限公司生产试剂盒。血清乙肝抗原一抗体标志物检测采用深圳雷杜酶标仪，上海科华生物工程有限公司乙型肝炎诊断试剂盒。
1.3 方法
1.3.1 HBV-DNA采用核酸扩增(PCR)荧光定量检测法，用已知含量梯度(2.0×10^6，2.0x10^5，2.0×10^4，2.0×10^3)的HBV-DNA标准品为参照物，经荧光定量PCR扩增后所得荧光值经数据转换，制出一条标准曲线，待测样品的荧光值进行对比得出其样本DNA含量。检测中同时设置阴阳性对照。严格按照试剂盒操作要求，在对样本做了预处理之后取2ul上清液加入反应管上机，按下列条件进行扩增：①先93℃2min；②然后按93℃45s～55℃60s10个循环后进入下一环节；③93℃30s～55℃45s 30个循环后，反应结果由仪器自动分析，直接得出血清标本的病毒拷贝数。
1.3.2 乙肝五项采用 ELISA法测定，试剂盒购自上海科华生物工程有限公司乙型肝炎诊断试剂盒，操作严格按照试剂盒说明。
1.4 结果判断
根据试剂盒说明 PCR 荧光定量<1×1O^3拷贝数/ml为无复制，判断为阴性。≥1.1×10^3拷贝数/ml为病毒复制，判断为阳性。
1.5 统计学处理
各种类型人为分组，见下表。 HbsAg-HbeAg-HbcAb(1，3，5) 阳性， HbsAg-HbeAb-HbcAb(1，4，5) 阳性，HbsAg- HbcAb(1，5)阳性，HbsAg-HbeAg(1，3)阳性，HbsAg(1阳)，乙肝病毒标志物与荧光定量PCR 扩增结果相互比较，得出比率。
2 结果
700 例HBV-DNA定量检测结果中，345例HBV-DNA阴性，355 例阳性；>10^5拷贝例数252例。EIISA检测HBV标志物与HBV-DNA含量的结果比较，乙肝HbsAg，HbeAg，HbcAb阳性组(俗称大三阳)254例，其中HBV-DNA阳性检出率为98%，阴性检出率为2%；乙肝HbsAg，HbeAb，HbcAb 阳性组(俗称小三阳)333例，标志物中所占比例最高[5]，HBV-DNA阳性检出率为19.5%，阴性检出率为80.5%；HbsAg-HbcAb阳性100例，阳性检出率为33%，阴性检出率为67%；HbsAg-HbeAg阳性13例，阳性检出率为61.6%，阴性检出率为38.4%。HbsAg阳5例，阳性检出率为0。
3 讨论
荧光定量PCR方法，是使分析扩增产物全过程在一个封闭体系下完成，并且进行实时动态监测，图形直观，自动得出定量结果，且结果具有更高的特异性和敏感性。本组HBV-DNA定量结果显示，700例病人血清PCR阳性检出率达50.7(355/700)， HbsAg，HbeAg，HbcAb 阳性组(俗称大三阳)254例，其中HBV-DNA阳性检出率98%；>10^5以上210例，占83%；阴性检出率2%；乙肝HbsAg，HbeAb，HbcAb阳性组(俗称小三阳)333例，HBV-DNA阳性检出率19.5%，>10^5以上23例，占6.9%，阴性检出率80.5%；HbsAg- HbcAb阳性100例，阳性检出率33%，>10^5以上，11例，占11%，阴性检出率67%；HbsAg-HbeAg阳性13例，阳性检出率61.6%，>10^5以上，8例，占61.6%，阴性检出率38.4%。资料显示，大三阳也有少量病例病毒不复制，即为阴性。而小三阳，主要为阴性，但也有部分病例出现阳性结果。小三阳患者中HbeAb的出现，传统认为乙肝病毒DNA 含量下降，传染性降低.但实际并不表示患者体内已没有病毒复制， (下转至第40页)
(上接至第22页)
由于HbeAg前体的分泌变异可以在血清中不表达出HbeAg，因而HbeAg阴性仍可引起宿主持续免疫应答，表现为HbeAb阳性，故小三阳患者同样有传染性。至于其他类型有阴有阳，分析提示HbeAg的存在与HBV-DNA浓度有高度的相关性，此时肝炎病毒可能处于复制期，传染性较强。, http://www.100md.com(王莉萍 屈雪琴 郎玉霞)
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