四乙胺对Aβ140致伤的神经干细胞的存活及其Caspase—3表达的影响
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【摘要】目的探讨钾通道阻滞剂四乙胺(tetraethylammonium， TEA)在Aβl40致伤的神经干细胞增殖及凋亡中的作用。方法Aβl40与神经干细胞共孵育，诱导神经干细胞损伤，以 TEA作用于Aβl40致伤的神经干细胞，利用MTT 法和比色法分别检测神经干细胞在不同的时间点的存活率及Caspase3活性。结果Aβl40可使神经干细胞的存活率降低，呈时间依赖性； Aβl40与神经干细胞在不同的时间点共孵育后，Caspase3活性逐渐增加，在24 h达到高峰；加入TEA后，Aβl40致伤的神经干细胞的存活率增加，Caspase3活性表达下降。结论Aβl40对神经干细胞的致伤作用可能与钾通道的激活相关，TEA能够降低Aβl40对神经干细胞的致伤作用，减少神经干细胞的凋亡为治疗阿尔茨海默病提供了新的方法。
【关键词】阿尔茨海默病；四乙胺；β淀粉样多肽；神经干细胞
基金项目：黑龙江省佳木斯大学研究生创新科研项目资金(项目编号：YJSCX2011021JD)；黑龙江省科学技术研究项目(项目编号：2012772)
作者单位：154000佳木斯大学阿尔茨海默病(Alzheimers disease， AD)是与衰老相关， 以严重的高级认知功能障碍为特征的隐袭性、逐渐性进展的退行性脑病[1，2]。AD 发病机制极其复杂， 主要病理学特点是β淀粉样多肽(Aβ)聚集形成的老年斑(SP) 和神经原纤维缠结 (NFT) 的形成， 伴脑皮质层神经元减少[3，4]。在研究中发现，AD患者常伴发大脑海马区的萎缩和神经干细胞的减少。同时也证实Aβ具有神经元毒性作用[5]和诱导神经干细胞的凋亡[6]，Aβ诱导的神经元凋亡的同时均伴随钾通道激活，尤其是延迟整流钾电流增强[7]。TEA是钾通道阻滞剂，研究证实心肌细胞凋亡中钾通道阻滞剂能起到保护和抑制的作用[8]。本研究以钾离子通道阻滞剂TEA作用于Aβl40诱导的神经干细胞，观察神经干细胞存活和Caspase3活性的变化，探讨Aβ致伤的神经干细胞凋亡时钾通道阻滞剂TEA在其中的作用。
1资料与方法
11实验动物、主要试剂及仪器雄性 Wistar 大鼠(<24 h)，由佳木斯大学动物中心提供；DMEM/F12(Gibco)； 四乙胺(tetraethylammonium，TEA)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、多聚赖氨酸 (Sigma公司)；胎牛血清(北京中杉金桥公司)；酶标计数仪ELX800(BioTEK公司)；Aβ140(Biosouxee公司)；Caspase分析试剂盒(美国Promega公司)。Nestin(北京博奥森生物技术有限公司)；IBE2003倒置荧光显微镜(重庆光学仪器厂)。
12大鼠海马区神经干细胞的分离与传代培养及鉴定新生的Wistar 大鼠(<24 h)，无菌操作打开颅腔并取海马组织，用Hanks液进行漂洗，将组织剪成1 mm3左右的小块加入培养液(DMEM/F12 1∶1，2%B27，bFGF 20 μg/L，表皮生长因子20 μg/L)5 ml，细滴管轻轻吹打后，制成单细胞悬液，调整一定浓度后接种于培养瓶中，将其放入5%CO2培养箱中，每3 d换半量培养液一次，每7 d传代一次，方法同上。取传代培养的神经球涂布在001%多聚赖氨酸的无菌盖玻片上，37℃，5%CO2培养箱培养2 h后，用001 mPBS漂洗，吹干后行Nestin细胞免疫化学检测。
13实验分组实验共分四组：Aβ140组：在传三代后的神经干细胞加入Aβ140 5 μM；Aβ140+TEA组：在Aβ140 5 μM孵育前30 min加入TEA 5 mM；空白对照组：加入等量的培养液的神经干细胞培养组；TEA对照组：神经干细胞加入TEA 5 mM。上述各组分别在0 h，12 h，24 h和48 h个时间点行细胞活性及凋亡检测。
14MTT法检测神经干细胞的存活率四组传代后的神经干细胞经不同处理后，停止培养前4 h将每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl使终浓度为 1 mg/ml，放置37℃培养箱继续培养4 h，用翻板法将96孔板内的培养基弃去，在每孔中加入溶解液 DMSO 150 μl，振荡 10 min使其充分溶解结晶产物。在酶标仪上以波长570nm检测每孔的OD值。所检测OD值的大小可反映细胞代谢活性的强弱。每组设3个孔，实验重复3次，细胞存活率的计算：细胞存活率=试验组光吸收值/对照组光吸收值×100% ......
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