神经干细胞基因修饰治疗脊髓损伤
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)11-1671-04
脊髓损伤(SCI)的修复是医学界长久以来的梦想，随着分子生物学和基因治疗技术的飞快发展，这一梦想已经有了实现的可能。采用神经营养因子基因修饰神经干细胞移植治疗SCI已被公认为最新、最有前途的治疗方法之一。即通过基因修饰使神经干细胞表达外源性基因，然后将其移植到受损部位，使它们分泌大量的治疗性神经营养因子，防止神经元死亡并促进神经再生与功能恢复。本文拟就神经营养因子(NTF)的种类、功能与作用机理，神经干细胞的特点及功能，神经营养因子对神经干细胞增殖和分化的影响，神经干细胞转基因治疗方法及载体的选择以及存在的问题与展望加以综述。
1 NTF的种类、功能及对SCI的作用机理
NTF是一类由神经元、神经胶质细胞及神经支配靶组织产生的能对中枢和外周神经发挥营养作用的特殊蛋白质分子，能支持受损中枢神经系统神经元的存活，刺激轴突的再生等。其分子量较大，不能透过血脑屏障且半衰期短，效应的发挥主要由高亲和力受体Trk和低亲和力受体P75NGFR介导 [1] 。目前已知的NTF有20余种，研究较多的有神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样神经营养因子(IGF)、神经营养因子-3，4/5(NT-3，4/5)、白血病抑制因子(LIF)等。它们兼有神经元营养和促突起生长的双重生物学功能 [2] 。Bregman等 [3] 将胚胎神经组织及多种NTF植入成年鼠颈胸段SCI区，发现NTF能促进轴突的生长。
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NGF是Levi-Moutalcini R于1952年发现的细胞生长调节因子，主要作用于神经嵴起源的发育中的感觉神经元和交感神经元及前脑基底部某些胆碱能神经元。它是最具感觉和运动神经元营养活性的因子，能诱导感觉神经元和去甲肾上腺素能神经元纤维延伸，使局部运动神经元纤维发芽 [4] 。BDNF最具运动神经元营养活性，与NGF有50%同源性，其对多种感觉神经元、胆碱能神经元、多巴胺能神经元以及GABA能神经元的发育分化与生长再生具有维持和促进作用。在组织损伤后阻止运动神经元死亡作用方面BDNF与NT-3有相同效应。BDNF对交感和睫状神经节不起作用，但能阻止坐骨神经横切后大量运动神经元的死亡，且能挽救脊髓半切伤后的红核神经元 [5] 。NT-3可促进脊髓损伤后皮质脊髓束轴突生长及部分神经功能恢复，能减慢横切损伤脊髓神经元死亡速度 [6] 。GDNF是近年来发现的一种属于转化生长因子β超家族成员的新型神经营养因子，是目前发现的活性很强的又一运动神经元营养因子 [7] 。bFGF因与肝素亲和力高，故又称为肝素结合生长因子，其对各种体外培养神经元具有神经营养作用，表现为促进神经元的存活与生长 [8] 。bFGF对成体神经细胞有较好 的促有丝分裂作用，并影响运动神经元中降钙素基因相关肽上mRNA的表达变化 [9] 。许多学者已证明bFGF对脊髓神经元有选择性的促轴突生长和神经营养作用 [10，11] 。bFGF的作用谱广泛，生物学效应表现出神经系统的多功能性。Teng YD等 [12] 将bFGF注入成年大鼠胸髓损伤区，5周后发现bFGF能促使脊髓前角运动神经元长期存活，改善实验性脊髓损伤后的呼吸功能。
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2 神经干细胞的特点及功能
干细胞是指同一世系相对未分化的细胞，在整个生命过程中保持增殖、自我更新和多分化的能力，以提供特化的细胞来补充死亡或缺损的细胞。神经干细胞(NSCs)是一种能产生神经元和胶质细胞的前体细胞，具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能和自我更新并足以提供大量神经组织细胞的潜能。神经干细胞易于遗传调控，对中枢神经系统(CNS)无侵袭性，有助于中枢神经系统损伤的修复;它能重建SCI部位的神经元序列。且经NTF修饰后可加强轴突的再生。在体外，神经干细胞能在含有表皮生长因子(EGF)和(或)碱性成纤维生长因子(bFGF)的无血清培养基中不断增殖，并维持干细胞的特征。有学者报道EGF和bFGF可促进神经干细胞和祖细胞增殖，这些细胞可传40～50多代后仍保持干细胞的特性[13] 。神经干细胞贴壁后在含1%血清的培养液中能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。神经干细胞被移植回中枢神经系统后，它能进一步迁移、分化，与宿主神经元整合并发挥神经功能，这完全改变了中枢神经系统损伤后神经元无法再生修复的传统观念，使得神经干细胞移植治疗脊髓的损伤成为当今神经科学的一个热点。研究表明，神经干细胞的移植治疗能促进GAP43mRNA的转录和ChAT阳性为主的运动神经纤维的再生，从而促进脊髓损伤后神经结构的修复和功能的恢复。神经干细胞的促髓鞘再生作用也许是产生功能恢复的机制之一 [14] 。但是，神经干细胞移植回中枢后究竟对何种神经元起作用以及神经干细胞移植治疗中枢神经损伤的机制尚缺乏深入的研究和定量的评价。
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神经干细胞一般可由胚胎中枢神经组织分离而得，并在组织培养中扩增。胚胎组织中存在各种干细胞，包括神经干细胞，现在已被分离和进行体外培养，在环境适宜时还可分化为各种神经元和神经胶质细胞。Svendsen等 [15] 报道了自小鼠胚胎和人胚组织中分离出神经干细胞。治疗脊髓损伤有前景的细胞是来源于胚胎脊髓的一种定向为神经元的前体细胞(NRPs)。在体外，这些细胞能被扩增，并且可分化为多种类型的神经元。Han等 [16] 在研究NRPs细胞的发育过程中将其移植到脊髓损伤的大鼠模型，观察其生物学特性，初步的结果显示移植的NRPs在受损部位可存活至少1个月，并且有迁移现象。
更令人兴奋的是，神经生物学已经证实，成年哺乳动物体内也存在神经干细胞，这些干细胞一般处于静止或缓慢生长状态，在损伤之后，干细胞可以很快扩增以取代失去的细胞，同时仍保留一部分备用。如果能从病人身上分离出这种成体干细胞，诱导它们分化并指导它们进行特化发育，而后将它们移植回病人体内，这样的细胞不会发生排斥现象。进行这样的治疗，显然会降低、甚至避免使用来源于人体胚胎或人体胎儿的干细胞。从而成体干细胞显示出重要的应用价值。目前人们普遍认为，嗅球粘膜处的细胞是出生后直至成年仍然保持分裂能力的神经元。但有人研究发现，嗅球内神经元轴突的生长受到一种嗅球成鞘细胞的支持，这种细胞具有许旺氏细胞和星形胶质细胞的特征，而且还能伴随嗅球的轴突进入中枢神经系统。Li [17] 等进一步将从成年大鼠嗅球处取得的成鞘细胞在体外培养后植入皮质脊髓束的损伤部位，发现植入的细胞形成一个连续的“桥”通过损伤区，在再生轴突上可观察到由成鞘细胞形成的髓鞘，且轴突可长入损伤区直到已溃变的尾侧束部分。除嗅粘膜外，在纹状体、海马齿状回、小脑和脊髓等处都分离出一些神经胶质细胞。Chiasson [18] 等认为，虽然成年哺乳动物的前脑室管膜和膜下区细胞都有增殖的能力，但只有膜下区细胞具有神经干细胞的特征，即能自我更新和多向分化。Johansson等 [19] 研究认为成年大鼠的室管膜细胞就是神经干细胞，此处的细胞可快速增殖，然后迁移到嗅球处。他们还观察到，脊髓损伤后，室管膜细胞能急剧增殖并迁移到损伤处分化为星形胶质细胞参与瘢痕组织的形成。这一研究结果对脊髓损伤的治疗具有重大意义。如果能确定在人类成年后的室管膜细胞中存在神经干细胞，则可用适当方法从自体内取得此种细胞(如抽提脑脊液)，经体外培养扩增后作为移植物再植入患者体内，加用合适的方法诱导细胞分化为各种神经元和神经胶质细胞，将是一种有希望应用于临床的方法。
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3 神经营养因子对神经干细胞增殖和分化的影响
神经营养因子不仅对中枢和周围神经系统神经元的存活及其突起生长有促进作用，也对神经干细胞和祖细胞的增殖、分化起一定的作用。
EGF和bFGF 2 是有丝分裂原，对神经干细胞和祖细胞的增殖起重要作用。在体外培养中，EGF可诱导来自胚胎的神经干细胞增殖，产生由未分化细胞组成的细胞球，这些细胞能表达神经上皮细胞特有的Nestin。bFGF 2 可诱导神经干细胞增殖，调节发育中的神经干细胞分化成神经元和神经胶质细胞，如能诱导两类祖细胞的增殖和分化:(1)双潜能祖细胞，将分化成神经元和星形胶质细胞;(2)单潜能祖细胞，产生仅具有神经元特性的细胞 [20] 。同时，bFGF 2 对神经干细胞的存活、增殖和分化具有剂量依赖性，在一种含有低浓度bFGF 2的基本培养液中，神经干细胞呈现神经元的命运，随着bFGF 2 水平的增加则分化为胶质细胞 [21] 。Vescovi等 [22] 在培养人胚胎间脑神经干细胞时研究了两种因子的浓度关系，通过多个浓度组合发现，单独应用bFGF 2 和EGF时，神经干细胞在培养一段时间后即死亡，而只有将两者同时使用方可刺激神经干细胞的增殖。当这些细胞因子被撤除后，再用其它的特定因子处理，神经干细胞将会向特定细胞类型分化。bFGF 2 和EGF对神经干细胞的促增殖作用并不相同。有研究表明，bFGF 2 在神经干细胞增殖的早期阶段发挥促有丝分裂的作用，使神经干细胞获得对另一作用更强的促有丝分裂因子EGF的反应性，在增殖后期，EGF对神经干细胞的增殖刺激作用明显增强 [23] 。
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Shetty等 [24] 报道，在体外，脑源性神经营养因子(BDNF) 可维持乳鼠海马神经干细胞的存活，并能诱导它们分化为锥体神经元样细胞。Chow等 [25] 将大鼠脊髓半横断后，移植胎鼠脊髓神经干细胞，同时给予BDNF，观察到向神经元方向分化，而没有给予BDNF的对照组仅分化为星形胶质细胞和少突胶质细胞。睫状神经营养因子(CNTF)可诱导CNS多能干细胞分化为星形胶质细胞 [26] 。神经营养素-3(NT-3)可调控大脑皮质神经前体细胞分化，用抗体阻断NT-3的作用可显著抑制它们分化为神经元。BDNF和NT-3可促进大脑皮层神经前体细胞分化为神经元，但需要这些细胞能表达受体Trk B和Trk C(属于受体酪氨酸激酶的Trk家族);神经营养因子刺激受体酪氨酸激酶，导致几种细胞内信号分子的活化，其中最主要的是MAP激酶的磷酸化 [27] 。有学者认为，bFGF和NT-3是促进含有钙结合蛋白的海马神经元分化的因子 [28] 。
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最近，P.Lu等 [29] 报道，体外培养的小鼠C17.2神经干细胞克隆能自发分泌大量NGF、BDNF、CDNF等，但没有NT-3的分泌;而NT-3转导的小鼠C17.2神经干细胞克隆在分泌大量NT-3的同时，NGF、BDNF的分泌量也增加，GDNF的分泌却降至可检测水平线以下。体内试验表明，神经干细胞产生的生长因子水平与观察到的轴突生长模式正相关。
4 神经干细胞转基因治疗方法及载体的选择
神经干细胞基因修饰治疗脊髓损伤是近年发展起来的一种生物治疗技术。移植到损伤脊髓内的神经干细胞要求容易大量获得、扩增和储存，并且易于基因操作。它们也应该能在损伤部位存活相当长的时期，与宿主脊髓组织整合。Martinez等 [30] 报道将神经干细胞作为细胞系培养转导后，移植到受损区，移植细胞存活、整合、分化为神经元和胶质细胞，阻断了神经元变性，促进了脊髓功能恢复。Rubio等 [31] 将BDNF基因转导至哺乳动物神经干细胞中，构建成分泌BDNF的神经干细胞系，移植入新纹状体部位发现其生存情况优于对照组，分泌的BDNF能够保护和促进胆碱能神经元生存和增殖。应用转基因技术还可以使神经干细胞生存率大大增加，成为更稳定的基因移植载体。应用猿猴病毒40(SV40)的病毒质粒载体将large T抗原导入来源于胚鼠的神经干细胞中，每一个表达large T抗原的细胞系均可以在不含EGF的培养基中进行细胞分裂，而且可以使细胞克服血清的生长抑制作用，能够在含有10%(体积分数)胎牛血清的培养基中生长增殖，可以有效地抵抗凋亡的发生。通过检测large T抗原各种已知的变异情况对细胞凋亡的影响。发现large T抗原的J结构域和Rb结合基元(Rb binding motif)在此过程中发挥决定性作用 [32] 。因此可以将large T抗原转导入神经干细胞中，使神经干细胞成为永久稳定的不死细胞系，从而成为基因治疗的最理想载体。
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基因转染使用载体可分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体转染率高，表达较稳定，容易获取，可感染各时期细胞是其主要优点，但安全性问题仍是其应用的最大障碍。Himes等 [33] 应用逆转录病毒作载体将NTF转至神经干细胞并移植到大鼠脊髓损伤部位，发现转染细胞2个月后存活良好并较稳定表达NTF。非病毒载体没有类似病毒载体的安全性问题，免疫原性弱，容量大，比较适用于体内基因治疗途径，尤其目前发现多价阳离子脂质体转染效率更高，几乎无免疫排斥，毒性低，方法简单 [34] ，但该方法的主要不足是基因不能长期表达。两类载体均有自身优缺点，应在不同情况下应用不同载体。
5 存在问题及展望
神经干细胞基因治疗是上世纪90年代才发展起来的分子生物学在医学领域的重要应用，是极有前途的一种治疗方法。在动物实验上已取得了令人鼓舞的进展。但是必须看到将神经干细胞真正应用于临床治疗还要经历一段时间，许多问题有待解决。(1)目的基因:外源基因在体内长期有效表达必须接受机体生理信号的调控，只有构建具有调控序列的基因才能改善基因治疗的疗效。因此，必须对基因结构以及表达核调控的分子机制进行深入研究，为构建理想的治疗基因提供依据。(2)载体:目前无论是病毒还是非病毒载体，转基因的安全性问题及稳定表达问题仍有待解决。就逆转录病毒而言，主要存在滴度不高，靶向性不强及安全性问题;腺病毒主要是免疫性太强。对目前载体应作进一步研究与改进工作。神经干细胞在脊髓内长期存活和持续表达仍未很好解决，载体毒性与免疫原性是其重要原因。尽管CNS有免疫豁免性，且已使用自体移植、免疫隔离及免疫抑制等方法，但仍不理想。如何提高靶细胞抗病毒能力及寻找最适于神经系统表达的载体是目前存在的关键问题。再生轴突几乎不能离开移植区长入正常脊髓，移植细胞持续过度表达NTF也许妨碍轴突进入正常脊髓 [35] ，要求在细胞移植的技术和方法、表达的调控等方面进行大量的更深入的研究。(3)靶细胞:理论上讲神经干细胞是最佳受体细胞，但其属于终末分化前体细胞，增殖能力较弱，获取、培养与基因修饰均较困难;基因修饰后植入CNS不能长期存活是一个棘手问题。对于神经干细胞的分化和功能修复机制也不清楚，移植后的细胞能否与体内细胞整合，建立起正常的神经系统突触联系还需进一步研究。其增殖和定向诱导分化机制的最终阐明，将有赖于分子生物学、发育生物学等生物学科的相互协作和研究方法的进一步完善。
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虽然到目前为止，神经干细胞基因修饰治疗SCI的研究还处于试验阶段，尚有许多关键性问题未解决，但已显示了巨大的潜在价值和诱人前景 [36] 。研究者认为未来对神经干细胞的研究将集中在以下几个方面:第一，进一步研究神经干细胞生物学特征以及分离、纯化和扩增的条件;第二，人类神经干细胞在中枢内的定位、扩增及治疗SCI的作用机制等等。神经干细胞体外培养已成为研究神经系统起源、发育、基因转移、损伤修复以及细胞移植的重要手段。神经干细胞在神经系统损伤后修复治疗中的机制及意义日益成为人们研究的焦点。如果我们找到NTF在SCI中再生的整合机制及相应目的基因开放与关闭机制，同时转入多种NTF，让其相互作用，相互调节，就能更有效地促进脊髓的神经组织不断再生;如果我们发现更容易获取的成体神经干细胞，并能在体外大量增殖，培育出与受体完全匹配的特异性神经细胞系，则可为细胞移植提供广泛来源，同时避免免疫排斥反应;或者，将此技术与目前研究较多的胚胎脊髓移植技术、外周神经移植技术等结合起来，促进SCI的修复。毫无疑问，随着人们对脊髓再生研究的不断深入和基因工程技术的迅猛发展，神经干细胞转基因技术治疗SCI将有着巨大的应用前景。
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作者单位:1 400038重庆第三军医大学研究生管理大队一队
2 成都军区昆明总医院
(编辑 曲全), 百拇医药(阳运康)
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2 神经干细胞的特点及功能
干细胞是指同一世系相对未分化的细胞，在整个生命过程中保持增殖、自我更新和多分化的能力，以提供特化的细胞来补充死亡或缺损的细胞。神经干细胞(NSCs)是一种能产生神经元和胶质细胞的前体细胞，具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能和自我更新并足以提供大量神经组织细胞的潜能。神经干细胞易于遗传调控，对中枢神经系统(CNS)无侵袭性，有助于中枢神经系统损伤的修复;它能重建SCI部位的神经元序列。且经NTF修饰后可加强轴突的再生。在体外，神经干细胞能在含有表皮生长因子(EGF)和(或)碱性成纤维生长因子(bFGF)的无血清培养基中不断增殖，并维持干细胞的特征。有学者报道EGF和bFGF可促进神经干细胞和祖细胞增殖，这些细胞可传40～50多代后仍保持干细胞的特性[13] 。神经干细胞贴壁后在含1%血清的培养液中能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。神经干细胞被移植回中枢神经系统后，它能进一步迁移、分化，与宿主神经元整合并发挥神经功能，这完全改变了中枢神经系统损伤后神经元无法再生修复的传统观念，使得神经干细胞移植治疗脊髓的损伤成为当今神经科学的一个热点。研究表明，神经干细胞的移植治疗能促进GAP43mRNA的转录和ChAT阳性为主的运动神经纤维的再生，从而促进脊髓损伤后神经结构的修复和功能的恢复。神经干细胞的促髓鞘再生作用也许是产生功能恢复的机制之一 [14] 。但是，神经干细胞移植回中枢后究竟对何种神经元起作用以及神经干细胞移植治疗中枢神经损伤的机制尚缺乏深入的研究和定量的评价。
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神经干细胞一般可由胚胎中枢神经组织分离而得，并在组织培养中扩增。胚胎组织中存在各种干细胞，包括神经干细胞，现在已被分离和进行体外培养，在环境适宜时还可分化为各种神经元和神经胶质细胞。Svendsen等 [15] 报道了自小鼠胚胎和人胚组织中分离出神经干细胞。治疗脊髓损伤有前景的细胞是来源于胚胎脊髓的一种定向为神经元的前体细胞(NRPs)。在体外，这些细胞能被扩增，并且可分化为多种类型的神经元。Han等 [16] 在研究NRPs细胞的发育过程中将其移植到脊髓损伤的大鼠模型，观察其生物学特性，初步的结果显示移植的NRPs在受损部位可存活至少1个月，并且有迁移现象。
更令人兴奋的是，神经生物学已经证实，成年哺乳动物体内也存在神经干细胞，这些干细胞一般处于静止或缓慢生长状态，在损伤之后，干细胞可以很快扩增以取代失去的细胞，同时仍保留一部分备用。如果能从病人身上分离出这种成体干细胞，诱导它们分化并指导它们进行特化发育，而后将它们移植回病人体内，这样的细胞不会发生排斥现象。进行这样的治疗，显然会降低、甚至避免使用来源于人体胚胎或人体胎儿的干细胞。从而成体干细胞显示出重要的应用价值。目前人们普遍认为，嗅球粘膜处的细胞是出生后直至成年仍然保持分裂能力的神经元。但有人研究发现，嗅球内神经元轴突的生长受到一种嗅球成鞘细胞的支持，这种细胞具有许旺氏细胞和星形胶质细胞的特征，而且还能伴随嗅球的轴突进入中枢神经系统。Li [17] 等进一步将从成年大鼠嗅球处取得的成鞘细胞在体外培养后植入皮质脊髓束的损伤部位，发现植入的细胞形成一个连续的“桥”通过损伤区，在再生轴突上可观察到由成鞘细胞形成的髓鞘，且轴突可长入损伤区直到已溃变的尾侧束部分。除嗅粘膜外，在纹状体、海马齿状回、小脑和脊髓等处都分离出一些神经胶质细胞。Chiasson [18] 等认为，虽然成年哺乳动物的前脑室管膜和膜下区细胞都有增殖的能力，但只有膜下区细胞具有神经干细胞的特征，即能自我更新和多向分化。Johansson等 [19] 研究认为成年大鼠的室管膜细胞就是神经干细胞，此处的细胞可快速增殖，然后迁移到嗅球处。他们还观察到，脊髓损伤后，室管膜细胞能急剧增殖并迁移到损伤处分化为星形胶质细胞参与瘢痕组织的形成。这一研究结果对脊髓损伤的治疗具有重大意义。如果能确定在人类成年后的室管膜细胞中存在神经干细胞，则可用适当方法从自体内取得此种细胞(如抽提脑脊液)，经体外培养扩增后作为移植物再植入患者体内，加用合适的方法诱导细胞分化为各种神经元和神经胶质细胞，将是一种有希望应用于临床的方法。
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3 神经营养因子对神经干细胞增殖和分化的影响
神经营养因子不仅对中枢和周围神经系统神经元的存活及其突起生长有促进作用，也对神经干细胞和祖细胞的增殖、分化起一定的作用。
EGF和bFGF 2 是有丝分裂原，对神经干细胞和祖细胞的增殖起重要作用。在体外培养中，EGF可诱导来自胚胎的神经干细胞增殖，产生由未分化细胞组成的细胞球，这些细胞能表达神经上皮细胞特有的Nestin。bFGF 2 可诱导神经干细胞增殖，调节发育中的神经干细胞分化成神经元和神经胶质细胞，如能诱导两类祖细胞的增殖和分化:(1)双潜能祖细胞，将分化成神经元和星形胶质细胞;(2)单潜能祖细胞，产生仅具有神经元特性的细胞 [20] 。同时，bFGF 2 对神经干细胞的存活、增殖和分化具有剂量依赖性，在一种含有低浓度bFGF 2的基本培养液中，神经干细胞呈现神经元的命运，随着bFGF 2 水平的增加则分化为胶质细胞 [21] 。Vescovi等 [22] 在培养人胚胎间脑神经干细胞时研究了两种因子的浓度关系，通过多个浓度组合发现，单独应用bFGF 2 和EGF时，神经干细胞在培养一段时间后即死亡，而只有将两者同时使用方可刺激神经干细胞的增殖。当这些细胞因子被撤除后，再用其它的特定因子处理，神经干细胞将会向特定细胞类型分化。bFGF 2 和EGF对神经干细胞的促增殖作用并不相同。有研究表明，bFGF 2 在神经干细胞增殖的早期阶段发挥促有丝分裂的作用，使神经干细胞获得对另一作用更强的促有丝分裂因子EGF的反应性，在增殖后期，EGF对神经干细胞的增殖刺激作用明显增强 [23] 。
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Shetty等 [24] 报道，在体外，脑源性神经营养因子(BDNF) 可维持乳鼠海马神经干细胞的存活，并能诱导它们分化为锥体神经元样细胞。Chow等 [25] 将大鼠脊髓半横断后，移植胎鼠脊髓神经干细胞，同时给予BDNF，观察到向神经元方向分化，而没有给予BDNF的对照组仅分化为星形胶质细胞和少突胶质细胞。睫状神经营养因子(CNTF)可诱导CNS多能干细胞分化为星形胶质细胞 [26] 。神经营养素-3(NT-3)可调控大脑皮质神经前体细胞分化，用抗体阻断NT-3的作用可显著抑制它们分化为神经元。BDNF和NT-3可促进大脑皮层神经前体细胞分化为神经元，但需要这些细胞能表达受体Trk B和Trk C(属于受体酪氨酸激酶的Trk家族);神经营养因子刺激受体酪氨酸激酶，导致几种细胞内信号分子的活化，其中最主要的是MAP激酶的磷酸化 [27] 。有学者认为，bFGF和NT-3是促进含有钙结合蛋白的海马神经元分化的因子 [28] 。
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最近，P.Lu等 [29] 报道，体外培养的小鼠C17.2神经干细胞克隆能自发分泌大量NGF、BDNF、CDNF等，但没有NT-3的分泌;而NT-3转导的小鼠C17.2神经干细胞克隆在分泌大量NT-3的同时，NGF、BDNF的分泌量也增加，GDNF的分泌却降至可检测水平线以下。体内试验表明，神经干细胞产生的生长因子水平与观察到的轴突生长模式正相关。
4 神经干细胞转基因治疗方法及载体的选择
神经干细胞基因修饰治疗脊髓损伤是近年发展起来的一种生物治疗技术。移植到损伤脊髓内的神经干细胞要求容易大量获得、扩增和储存，并且易于基因操作。它们也应该能在损伤部位存活相当长的时期，与宿主脊髓组织整合。Martinez等 [30] 报道将神经干细胞作为细胞系培养转导后，移植到受损区，移植细胞存活、整合、分化为神经元和胶质细胞，阻断了神经元变性，促进了脊髓功能恢复。Rubio等 [31] 将BDNF基因转导至哺乳动物神经干细胞中，构建成分泌BDNF的神经干细胞系，移植入新纹状体部位发现其生存情况优于对照组，分泌的BDNF能够保护和促进胆碱能神经元生存和增殖。应用转基因技术还可以使神经干细胞生存率大大增加，成为更稳定的基因移植载体。应用猿猴病毒40(SV40)的病毒质粒载体将large T抗原导入来源于胚鼠的神经干细胞中，每一个表达large T抗原的细胞系均可以在不含EGF的培养基中进行细胞分裂，而且可以使细胞克服血清的生长抑制作用，能够在含有10%(体积分数)胎牛血清的培养基中生长增殖，可以有效地抵抗凋亡的发生。通过检测large T抗原各种已知的变异情况对细胞凋亡的影响。发现large T抗原的J结构域和Rb结合基元(Rb binding motif)在此过程中发挥决定性作用 [32] 。因此可以将large T抗原转导入神经干细胞中，使神经干细胞成为永久稳定的不死细胞系，从而成为基因治疗的最理想载体。
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基因转染使用载体可分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体转染率高，表达较稳定，容易获取，可感染各时期细胞是其主要优点，但安全性问题仍是其应用的最大障碍。Himes等 [33] 应用逆转录病毒作载体将NTF转至神经干细胞并移植到大鼠脊髓损伤部位，发现转染细胞2个月后存活良好并较稳定表达NTF。非病毒载体没有类似病毒载体的安全性问题，免疫原性弱，容量大，比较适用于体内基因治疗途径，尤其目前发现多价阳离子脂质体转染效率更高，几乎无免疫排斥，毒性低，方法简单 [34] ，但该方法的主要不足是基因不能长期表达。两类载体均有自身优缺点，应在不同情况下应用不同载体。
5 存在问题及展望
神经干细胞基因治疗是上世纪90年代才发展起来的分子生物学在医学领域的重要应用，是极有前途的一种治疗方法。在动物实验上已取得了令人鼓舞的进展。但是必须看到将神经干细胞真正应用于临床治疗还要经历一段时间，许多问题有待解决。(1)目的基因:外源基因在体内长期有效表达必须接受机体生理信号的调控，只有构建具有调控序列的基因才能改善基因治疗的疗效。因此，必须对基因结构以及表达核调控的分子机制进行深入研究，为构建理想的治疗基因提供依据。(2)载体:目前无论是病毒还是非病毒载体，转基因的安全性问题及稳定表达问题仍有待解决。就逆转录病毒而言，主要存在滴度不高，靶向性不强及安全性问题;腺病毒主要是免疫性太强。对目前载体应作进一步研究与改进工作。神经干细胞在脊髓内长期存活和持续表达仍未很好解决，载体毒性与免疫原性是其重要原因。尽管CNS有免疫豁免性，且已使用自体移植、免疫隔离及免疫抑制等方法，但仍不理想。如何提高靶细胞抗病毒能力及寻找最适于神经系统表达的载体是目前存在的关键问题。再生轴突几乎不能离开移植区长入正常脊髓，移植细胞持续过度表达NTF也许妨碍轴突进入正常脊髓 [35] ，要求在细胞移植的技术和方法、表达的调控等方面进行大量的更深入的研究。(3)靶细胞:理论上讲神经干细胞是最佳受体细胞，但其属于终末分化前体细胞，增殖能力较弱，获取、培养与基因修饰均较困难;基因修饰后植入CNS不能长期存活是一个棘手问题。对于神经干细胞的分化和功能修复机制也不清楚，移植后的细胞能否与体内细胞整合，建立起正常的神经系统突触联系还需进一步研究。其增殖和定向诱导分化机制的最终阐明，将有赖于分子生物学、发育生物学等生物学科的相互协作和研究方法的进一步完善。
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虽然到目前为止，神经干细胞基因修饰治疗SCI的研究还处于试验阶段，尚有许多关键性问题未解决，但已显示了巨大的潜在价值和诱人前景 [36] 。研究者认为未来对神经干细胞的研究将集中在以下几个方面:第一，进一步研究神经干细胞生物学特征以及分离、纯化和扩增的条件;第二，人类神经干细胞在中枢内的定位、扩增及治疗SCI的作用机制等等。神经干细胞体外培养已成为研究神经系统起源、发育、基因转移、损伤修复以及细胞移植的重要手段。神经干细胞在神经系统损伤后修复治疗中的机制及意义日益成为人们研究的焦点。如果我们找到NTF在SCI中再生的整合机制及相应目的基因开放与关闭机制，同时转入多种NTF，让其相互作用，相互调节，就能更有效地促进脊髓的神经组织不断再生;如果我们发现更容易获取的成体神经干细胞，并能在体外大量增殖，培育出与受体完全匹配的特异性神经细胞系，则可为细胞移植提供广泛来源，同时避免免疫排斥反应;或者，将此技术与目前研究较多的胚胎脊髓移植技术、外周神经移植技术等结合起来，促进SCI的修复。毫无疑问，随着人们对脊髓再生研究的不断深入和基因工程技术的迅猛发展，神经干细胞转基因技术治疗SCI将有着巨大的应用前景。
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作者单位:1 400038重庆第三军医大学研究生管理大队一队
2 成都军区昆明总医院
(编辑 曲全), 百拇医药(阳运康)